Bei der Röntgenaufnahme sieht man bei allen Formen in unterschiedlicher Ausprägung typische Skelettveränderungen, die als Dysostosis multiplex bezeichnet werden: Die Schädelkalotte ist verbreitert, die Schädelnähte sind vorzeitig verschlossen. Die Schädelbasis ist verdickt, die Sella turcica deformiert und j-förmig erweitert. Ein weiteres charakteristisches Merkmal ist die ovoide Form der Wirbelkörper, die im Säuglingsalter noch physiologisch ist. Aufgrund der Deformierung des Beckens wird im frühen Säuglingsalter die Diagnose einer Hüftdysplasie gestellt; später verstärkt sich die Hypoplasie des Corpus ossis ilii, bei weit ausladenden Beckenschaufeln sind die Scham- und Sitzbeine eher schlank. Die Schenkelhälse stehen in Valgusposition. Die Schlüsselbeine sind kurz und vermehrt gebogen. Die ruderblattförmigen Rippen verlaufen horizontal. Das insgesamt vergröberte Handskelett zeigt eine distale Zuspitzung der Phalangen (Zuckerhutphalangen).
Der sogenannte Berry-Test (Filterpapiertest) ist eine unspezifische Nachweismethode für Mukopolysaccharide im Urin. Dabei wird ein Urintropfen mit Toluidinblau gefärbt. Um eine sichere Aussage über die quantitative Mukopolysaccharid- Ausscheidung zu treffen, ist das Sammeln eines 24-Stunden- Urins notwendig.
Zeigt der Berry-Test eine vermehrte Mukopolysaccharid-Ausscheidung im Urin an, muss eine weitere Differenzierung mittels Elektrophorese erfolgen: Patienten mit Morbus Hurler, Hunter oder Maroteaux-Lamy scheiden vorwiegend Dermatansulfat aus, für den Morbus Morquio charakteristisch ist eine Keratansulfat-Ausscheidung. Der Nachweis von Heparansulfat lässt die vorläufige Diagnose eines Morbus Sanfilippo zu.
Zur endgültigen Bestätigung der Diagnose einer Mukopolysaccharidose ist der Nachweis des Enzymdefekts unerlässlich. Dieser kann aus Serum, Leukozyten oder Hautfibroblasten erbracht werden. Nicht alle Mukopolysaccharidosen können im Blut nachgewiesen werden. Ist es nötig, mehrere Unterformen der Mukopolysaccharidosen auszuschließen, ist eine Hautbiopsie für eine Fibroblastenkultur empfehlenswert. Die genaue Feststellung des Enzymdefekts ist vor allem dann unbedingt erforderlich, wenn sich Eltern zu einem weiteren Kind entschließen. Jede Schwangerschaft kann mittels Chorion- Biopsie oder Amniozentese rechtzeitig untersucht werden.